Dépistage Brettanomyces
Dossier Dépistage Brettanomyces
Méthodologie de dépistage et d'isolement de Brettanomyces sur le raisin: application à l'échelle parcellaire.
(1)Pascal Barbin, Pierre Strehaiano, Patricia Taillandier - (2) Jean-François Gilis
(1) Laboratoire de Génie Chimique, Bioprocédés et Systémes Microbiens
(2) SARL Oenodev
Matériel et Méthodes : Procédure de dépistage
Critères de sélectivité retenus
Le but recherché était de favoriser le développement de la levure Brettanomyces, probablement non majoritaire au sein de la niche écologique,
aux dépends des autres micro-organismes présents et en permettre alors l'identification et le dépistage sans être gêné par les genres beaucoup plus invasifs.
Un étude bibliographique nous a permis de retenir un certains nombre de caractéristiques physiologiques que nous avons exploité tout au long de
notre procédure pour cibler le genre Brettanomyces et le distinguer ainsi des autres espèces présentes.
- Pour se prévenir ainsi du développement des bactéries (acétiques, lactiques et autres), un antibactérien est à considérer : le chloramphénicol qui possède un spectre d'action large sur les bactéries, sans pour autant présenter d'action fongistatique qui pourrait être défavorable à la croissance de Brettanomyces.
- Contrairement à la grande majorité des levures non Saccharomyces qui sont présentes sur le raisin (dont les levures apiculées), Brettanomyces présente une bonne résistance à l'éthanol et sa croissance n'est pas inhibée en milieu liquide pour des concentrations en éthanol inférieures à 13% vol/vol. (Medawar 2003).
- De plus la levure Brettanomyces est résistante à l'actidione, contrairement au genre Saccharomyces qui subit une inhibition des voies de proteosynthése (Barnett et al. 1990).
- Par ailleurs, dans des conditions aérobie ou de semi aérobie, Brettanomyces est capable de synthétiser des quantité importante d'acide acétique à partir de glucose ou d'éthanol, mettant en avant le caractère « acidifiant » de cette levure (Ciani et Ferraro 1997).
- Enfin, Brettanomyces est capable, à partir d'acide p-coumarique (pouvant être naturellement présent dans le moût de raisin puis le vin) de produire des quantités importantes de 4 éthylphénols, responsable des odeurs animales qui lui sont reprochées (sueur, urine, crottin de cheval, cuir mouillé, ....), alors que les autres microorganismes présents dans l'environnement vitivinicole possèdent une aptitude très réduite voire absente à cette conversion en phénols volatils. (Chatonnet et al. 1992, Dias et al. 2003).
Echantillonnage : prélèvement sur pied, et préparation de l'échantillon.
Les grappes, ou des ailes de grappes (entre 100 g et 300 g) sont directement échantillonnées aseptiquement dans des sacs de prélèvement
stériles en utilisant des outils de coupe nettoyés à l'alcool.
Figure 1 : Echantillon de raisin dans un sac de prélèvement stérile.
Pour chaque échantillon, le raisin est écrasé directement dans le sac stérile, les rafles retirées, dans des conditions de stérilité maximales. Chaque poche ainsi obtenue est alors pesée. Pour chaque parcelle considérée et date de prélèvement, une corrélation « Masse de raisin prélevé - Volume de jus obtenu après "foulage" » est déterminée à partir d'échantillons de grappes témoins.
Nécessité d'une phase d'enrichissement.
D'une manière générale la microflore du raisin se compose d'une quantité très faible de micro-organismes présents sur la pellicule des baies.
Ainsi, une concentration cellulaire faible, à très faible ne peut être détectée par simple étalement direct sur milieu sélectif (la limite étant de
1 cellule par mL de moût après foulage). On comprend alors la nécessité d'une phase d'enrichissement (multiplication cellulaire/ accroissement de population)
qui doit être suffisamment longue pour permettre d'atteindre des niveaux de population détectables quelle que soit la population initiale.
De plus l'état physiologique des levures à la surface des baies de raisin ne garantit pas une croissance directe par étalement sur un milieu gélosé.
On rejoint alors la notion de Cellules Viables Non Cultivable (VNC), déjà évoquée par Millet et Lonvaud-Funel (2000) concernant d'autres microorganismes tels
que des bactéries. Dès lors, une étape d'activation en milieu liquide serait nécessaire. La phase d'enrichissement pouvant également jouer alors ce rôle.
Il nous est alors apparu comme impératif d'effectuer cet enrichissement microbien (accompagné de l'activation) afin de rendre détectables les
levures présentes. Pour ce faire chaque poche de jus de raisin obtenu après « foulage » des échantillons de grappes est alors complétée avec un volume
défini (fonction du volume de jus obtenu) d'une solution concentrée et sélective vis-à-vis de Brettanomyces répondant aux critères de sélection précédemment
cités. Les sacs sont alors laissés sans agitation entre 20 et 30°C pendant une durée que nous avons évaluée optimale à 2 mois (plus ou moins 2 semaines)
pour obtenir les résultats les plus significatifs de la présence ou non de la levure sur le raisin.
Figure 2 : Echantillon en cours d'enrichissement sélectif
Phases de contrôle et de confirmation
Au terme des 2 mois d'enrichissement en poches stériles, les échantillons sont traités afin de conclure à la présence ou non de Brettanomyces.
Plusieurs étapes sont alors considérées :
- Observations au microscope :
Dans un premier temps, une observation au microscope permet de juger du développement levurien et de faire un tri entre les échantillons négatifs
(aucun microorganisme visible) et les échantillons positifs probables (présence d'une microflore, avec soupçon de morphologie type Brettanomyces) ou positifs
(morphologies typiques).
Figure 3 : Visuel sous microscope (x400)
d'un échantillon en début d'enrichissement.
Figure 4 : Visuel sous microscope (x400)
d'un échantillon en fin d'enrichissement :
développement levurien, avec probables Brettanomyces
- Culture de confirmation sur milieux sélectifs :
Le critère morphologique n'étant pas en soi un critère absolu pour conclure quant à l'appartenance assurée des levures présentes au genre
Brettanomyces, il convient alors de soumettre les échantillons à une autre étape de contrôle.
Les échantillons présentant un quelconque développement levurien/microbien au terme de l'enrichissement liquide sont alors étalés sur
milieu solide sélectif qui permet de tester d'une part le caractère acidifiant (indicateur d'acidité) des levures présentes et leur aptitude d'autre
part à convertir l'acide coumarique (« sniffing » pour détecter la formation de 4-éthylphénol).
Cet étalement sur gel permet alors de récupérer des colonies isolées et d'effectuer des purifications clonales de colonies répondant positivement
aux différents critères de sélection. Etape d'isolement, en plus de l'approche « détection ».
- Test génétique :
De plus des tests génétiques ont été menés sur un certain nombre de colonies isolées à la suite de notre démarche complète appliquée à des échantillons
prélevés sur le vignoble de Buzet. Ainsi des identifications par PCR spécifique Brettanomyces (méthode décrite par Trevor, Phister and Mills 2003) ont été utilisés
et nous a permis de confirmer l'appartenance des souches isolées à l'espèce Brettanomyces bruxellensis, comme nous le supposions.
Dès lors, nous validons notre démarche d'un point de vue détection spécifique Brettanomyces. Et la possibilité d'isoler des souches appartenant à cette espèce.
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