Ricerca Brettanomyces
Metodologia di ricerca e isolamento del lievito Brettanomyces sull'uva: applicazione a livello di appezzamento
Procedura di ricerca
Criteri di selettività presi in considerazione
Lo scopo cui si è teso è stato quello di favorire lo sviluppo, probabilmente non maggioritario, del lievito Brettanomyces, all'interno della nicchia ecologica, a scapito degli altri microrganismi presenti, di permetterne così l'identificazione e di condurvi ricerche senza essere ostacolati da generi molto più invasivi.
Uno studio bibliografico ci ha consentito di prendere in considerazione una interessante quantità di caratteristiche fisiologiche cui abbiamo fatto ricorso nel corso del nostro procedimento per individuare il genere Brettanomyces e differenziarlo così dalle altre specie presenti.
- Per rendersi dunque conto dello sviluppo dei batteri (acetici, lattici e di altro genere), bisogna prendere in considerazione un antibatterico: il cloramfenicolo, che possiede un ampio spettro di azione sui batteri, senza per contro presentare un'azione fungistatica che potrebbe risultare sfavorevole alla crescita del Brettanomyces.
- Contrariamente alla gran maggioranza dei lieviti diversi dal Saccharomyces presenti sull'uva (tra cui i lieviti apiculati), il Brettanomyces presenta una buona resistenza all'etanolo e la sua crescita non è inibita in ambiente liquido da concentrazioni di etanolo inferiori al 13% vol/vol. (Medawar 2003).
- Inoltre il lievito Brettanomyces è resistente all'actidione, diversamente dal genere Saccharomyces che subisce un'inibizione delle vie di proteosintesi (si vedano Barnett et al. 1990).
- D'altronde, in condizioni aerobiche o semi-aerobiche, il Brettanomyces è in grado di sintetizzare delle quantità considerevoli di acido acetico partendo dal glucosio o dall'etanolo, che fanno emergere il carattere « acidificante » di questo lievito (Ciani e Ferraro 1997).
- Infine il Brettanomyces è in grado, partendo dall'acido p-coumarico (che può essere presente naturalmente nel mosto dell'uva e poi nel vino) di produrre delle quantità importanti di 4 etilfenolo, responsabile degli odori animali che gli vengono rimproverati (sudore, urina, sterco di cavallo, cuoio bagnato, ....), mentre gli altri microrganismi presenti nell'ambiente vitivinicolo possiedono una predisposizione molto ridotta o addirittura assente a operare questa conversione in fenoli volatili. (Chatonnet et al. 1992, Dias et al. 2003)
Campionamento: prelevamento dalla pianta e preparazione del campione.
I grappoli, o delle ali di grappoli (tra i 100 g e i 300 g) sono campionati direttamente in modo asettico entro sacchi di prelevamento sterili utilizzando degli strumenti da taglio puliti con alcool
Per ciascun campione, l'uva viene schiacciata direttamente nel sacco sterile, i raspi vengono eliminati, in condizioni di sterilità massima. Ciascun sacchetto così ottenuto viene dunque pesato. Per ogni lotto di terreno considerato e per ogni data di prelevamento viene stabilita una correlazione « Massa di uva prelevata - Volume di succo ottenuto dopo la "pigiatura" partendo da saggi di grappoli campione.
Figura 1: Campione di uva in un sacco di prelevamento sterile
Necessità di una fase di arricchimento
In linea generale la microflora dell'uva si compone in misura molto ridotta di microrganismi presenti sulla pellicola degli acini.
Sicché, una concentrazione cellulare da debole a molto debole non può essere rilevata per semplice distribuzione diretta sul mezzo selettivo (con limite di 1 cellula per ml di mosto dopo la pigiatura). Si comprende dunque la necessità di una fase di arricchimento (moltiplicazione cellulare/accrescimento della popolazione) che deve essere sufficientemente lunga per consentire di raggiungere livelli di popolazione rilevabili qualsiasi sia la popolazione iniziale.
Inoltre lo stato fisiologico dei lieviti sulla superficie degli acini di uva non garantisce una crescita diretta per distribuzione in un ambiente gelatinoso. Ci si ricollega allora al concetto di Cellule Vitali Non Coltivabili (VNC), già accennato da Millet e Lonvaud-Funel (2000) concernente altri microrganismi come i batteri. Pertanto, sarà necessario uno stadio di attivazione in ambiente liquido. Questo ruolo potrà essere dunque ugualmente svolto dalla fase di arricchimento.
Ci è quindi sembrato imprescindibile effettuare questo arricchimento microbico (accompagnato dall'attivazione) per rendere individuabili i lieviti presenti. Per fare ciò, ciascun sacchetto di succo di uva ottenuto dopo la « pigiatura » dei campioni di grappoli viene quindi completato con l'aggiunta di un volume definito (che dipende dal volume di succo ottenuto) di una soluzione concentrata e selettiva a fronte del Brettanomyces che risponde ai criteri di selezione precedentemente ricordati.
I sacchi sono poi lasciati stabilizzare senza essere agitati a una temperatura compresa tra i 20 e i 30°C per un periodo che abbiamo ritenuto come ottimale di due mesi (ma sono accettabili più o meno due settimane) in modo da ottenere i risultati più significativi circa la presenza o meno di lievito sull'uva.
Figura 2: Campione in corso di arricchimento selettivo
Fasi di controllo e di conferma
Allo scadere dei due mesi di arricchimento in sacchetti sterili, i campioni vengono esaminati al fine di concludere se il Brettanomyces sia presente o meno.
Vengono allora considerate svariate fasi.
- Osservazioni al microscopio :
In un primo tempo, un'osservazione al microscopio permette di giudicare il grado di sviluppo del lievito e di fare una cernita tra i campioni risultati negativi (privi di micro-organismi visibili) e i campioni probabilmente positivi (presenza di una microflora, con dubbio che si tratti di una morfologia di tipo Brettanomyces) o positivi (morfologie tipiche).
Figura 3: Visuale sotto microscopio (x400) di un campione all'inizio dell'arricchimento
Figura 4: Visuale sotto microscopio (x400) di un campione alla fine dell'arricchimento: sviluppo del lievito con probabile Brettanomyces
- Coltura di conferma su terreni selettivi :
Dal momento che il criterio morfologico in sé non è un criterio assoluto per trarre conclusioni riguardo all'appartenenza certa dei lieviti presenti al genere Brettanomyces, conviene allora sottoporre i campioni a un'altra fase di controllo.
I campioni che presentano un qualunque sviluppo di lievito/microbico al termine dell'arricchimento liquido vengono allora distribuiti su un mezzo selettivo solido che permette di esaminare da un lato il carattere acidificante (indicatore di acidità) dei lieviti presenti e d'altro lato la loro predisposizione a trasformare l'acido coumarico (« sniffing » per rilevare la formazione di 4-etilfenolo).
Questa distribuzione su gel permette allora di recuperare delle colonie isolate e di effettuare delle purificazioni clonali delle colonie che rispondono positivamente ai diversi criteri di selezione. Fase di isolamento, oltre all'approccio « rilevamento »
- Test genetico :
Inoltre, su un certo numero di colonie isolate a seguito del nostro approccio completo applicato ai campioni prelevati sul vigneto di Buzet, sono stati condotti test genetici. Così sono stati utilizzati metodi di identificazione del Brettanomyces ottenuta mediante un'analisi specifica delle reazioni a catena (PCR) (metodo descritto da Trevor, Phister e Mills 2003), i quali ci hanno consentito di confermare l'appartenenza dei ceppi isolati alla specie Brettanomyces bruxellensis, come supponevamo.
Pertanto, convalidiamo il nostro approccio dal punto di vista del rilevamento specifico del Brettanomyces. E la possibilità di isolare dei ceppi appartenenti a questa specie.
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Pascal Barbin, Pierre Strehaiano, Patricia Taillandier (Laboratorio di Ingegneria chimica, processi biologici e sistemi microbici), Jean-François Gilis (Oenodev)
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