Detección de Brettanomyces
Metodología de detección y aislamiento de Brettanomyces en la uva: aplicación a escala parcelaria.
Materiales y método
Procedimiento de Detección - Criterios de selección aplicados
El objetivo consistió en favorecer el desarrollo de la levadura Brettanomyces, probablemente no mayoritaria en el nicho ecológico, en detrimento de los otros microorganismos presentes, y permitir entonces su identificación y detección sin ninguna perturbación por parte de los géneros mucho más invasores.
Un estudio bibliográfico nos ha permitido seleccionar un cierto número de características fisiológicas que hemos analizado a lo largo de todo nuestro procedimiento, a fin de orientar el análisis hacia el género Brettanomyces y distinguirlo así de las otras especies presentes.
- De este modo, a los fines de la prevención del desarrollo de las bacterias (acéticas, lácticas y otras), cabe tener en cuenta un producto antibacteriano: el cloramfenicol, que posee un amplio espectro de acción sobre las bacterias, sin presentar no obstante una acción que podría ser desfavorable para el crecimiento de la Brettanomyces.
- Contrariamente a la gran mayoría de las levaduras no Saccharomyces que se hallan presentes en la uva (entre ellas las levaduras apiculadas), la Brettanomyces presenta una buena resistencia al etanol y su crecimiento no se ve inhibido en medio líquido para concentraciones de etanol inferiores al 13% en volumen (Medawar 2003).
- Además, la levadura Brettanomyces es resistente a la actidiona, a diferencia del género Saccharomyces que sufre una inhibición de las vías de proteosíntesis (Barnett y otros. 1990).
- - Por otra parte, en condiciones aeróbicas o semi-aeróbicas, la Brettanomyces puede sintetizar importantes cantidades de ácido acético a partir de glucosa o de etanol, poniendo de manifiesto la característica "acidificante" de esta levadura (Ciani y Ferraro 1997).
- Por último, la Brettanomyces tiene la capacidad de producir, a partir del ácido p-cumárico (cuya presencia en el mosto de uva y luego en el vino puede ser de origen natural), cantidades importantes de 4-etilfenoles, causa de olores de animal que se le critican (sudor, orina, estiércol de caballo, cuero mojado, etc.), mientras que los otros microorganismos presentes en el ambiente vitivinícola poseen una aptitud muy reducida o incluso nula para realizar esta conversión en fenoles volátiles. (Chatonnet y otros. 1992, Dias y otros. 2003).
Muestreo: toma de muestras en la viña, y preparación de las muestras
Las muestras de racimos, o de alas de racimos (de entre 100 y 300 g) se recogen y se guardan directamente de manera aséptica en bolsas de muestreo estériles, utilizando a tal fin herramientas de corte limpiadas con alcohol.
La uva de cada muestra se tritura directamente en la bolsa estéril y se retiran los raspones, siempre en condiciones de máxima esterilidad. Se pesa entonces cada una de las bolsas obtenidas.
Para cada parcela considerada y cada fecha de toma de muestras, se determina una correlación entre la masa de uva recogida y el volumen de jugo obtenido luego del estrujado, a partir de muestras testigo de racimos.
Figura 1: Muestra de uva en una bolsa de muestreo estéril
Necesidad de una fase de enriquecimiento
De una manera general, la microflora de la uva se compone de una cantidad muy baja de microorganismos presentes en la película de los granos.
De este modo, una concentración celular de baja a muy baja no puede ser detectada mediante la simple exposición directa en un medio selectivo (siendo el límite 1 célula por ml de mosto luego del estrujado). Se comprende entonces la necesidad de una fase de enriquecimiento (multiplicación celular / aumento de población) que debe ser lo suficientemente prolongada como para permitir alcanzar niveles de populación detectables sea cual fuere la población inicial.
Además, el estado fisiológico de las levaduras en la superficie de los granos no garantiza un crecimiento directo por exposición en medio gelosado. Nos acercamos entonces al concepto de Células Viables No Cultivables (VNC) ya citada por Millet y Lonvaud-Funel (2000) con respecto a otros microorganismos tal como bacterias. Sería por lo tanto necesaria una etapa de activación en medio líquido. La fase de enriquecimiento también podría eventualmente desempeñar esa función.
Nos pareció entonces indispensable efectuar ese enriquecimiento microbiano (acompañado de activación) para que las levaduras presentes puedan ser detectadas.
Con este fin, cada bolsa de jugo de uva obtenida luego del estrujado de las muestras de racimos se completa entonces con un volumen definido (en función del volumen de jugo obtenido) de una solución concentrada y selectiva con respecto a la Brettanomyces que satisfaga los criterios de selección antes citados. Se dejan entonces las bolsas sin agitación a una temperatura de 20 a 30°C durante un período cuya extensión óptima hemos estimado en 2 meses (más o menos 2 semanas) para obtener así los resultados más significativos de la presencia o no de la levadura en la uva.
Figura 2: Muestras en curso de enriquecimiento selectivo
Fases de control y confirmación
Una vez finalizado el período de 2 meses de enriquecimiento en bolsas estériles, las muestras se procesan con el fin de llegar a una conclusión acerca de la presencia o no de Brettanomyces. Se contemplan entonces varias etapas:
Observaciones con el microscopio
En una primera etapa, una observación con microscopio permite analizar el desarrollo de la levadura y realizar una selección entre las muestras negativas (ningún microorganismo visible) y las probables muestras positivas (presencia de una microflora con sospecha de la existencia de una morfología de tipo Brettanomyces) o positivas (morfologías típicas).
Imagen en microscopio (x400) de una muestra al inicio del proceso de enriquecimiento.
Figura 4: Imagen en microscopio (x400) de una muestra al final del proceso de enriquecimiento: desarrollo de levaduras, con probable presencia de Brettanomyces.
Cultivo de confirmación en medios selectivos
Dado que el criterio morfológico no es en sí mismo un criterio absoluto para llegar a una conclusión en cuanto a la segura pertenencia de las levaduras presentes al género Brettanomyces, es conveniente entonces someter las muestras a otra etapa de control.
Las muestras que presentan cualquier tipo de desarrollo de levaduras/microbiano en términos de enriquecimiento líquido se extienden entonces en medio sólido selectivo que permite ensayar por una parte el carácter acidificante (indicador de acidez) de las levaduras presentes, y por otra parte su aptitud para convertir el ácido cumárico ("olfateo" para detectar la formación de 4-etilfenol).
Esta exposición sobre gel permite entonces recuperar colonias aisladas y efectuar purificaciones clonales de colonias que responden positivamente a los diferentes criterios de selección. Etapa de aislamiento, además del método de "detección".
Prueba genética
Además, se realizaron pruebas genéticas en una cierta cantidad de colonias aisladas luego de la aplicación de nuestro proceso completo en muestras recogidas en el viñedo de Buzet. De este modo, se llevaron a cabo identificaciones mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica para Brettanomyces (método descrito por Trevor, Phister y Mills 2003), lo cual nos permitió confirmar la pertenencia de las cepas aisladas a la especie Brettanomyces bruxellensis, como lo suponíamos.
Por lo tanto, convalidamos nuestro proceso desde el punto de vista de la detección específica de Brettanomyces. Y la posibilidad de aislar cepas pertenecientes a esta especie.
Introducción | Materiales y método | Resultados | Conclusión | Bibliografía
(1) Pascal Barbin, Pierre Strehaiano, Patricia Taillandier - (2) Jean-François Gilis
(1) Chemical Engineering, Bioprocesses and Microbial Systems Laboratory
(2) Oenodev
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